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Qioptiq 光源推動PCR技術研發

發布日期:2020-03-11

淺談數字PCR

引言

近來,新冠肺炎的疫情牽動著人們的心,在醫療工作中快速、準確的確診感染者和判斷患者康復情況至關重要。社會大眾對于新冠病毒PCR核酸檢測的準確性、有效性也頗為關心,那么到底什么是PCR核酸檢測呢?

PCR技術(聚合酶鏈式反應技術, polymerase chain reaction),是通過模擬體內的DNA復制方式,在體外有選擇性地將特定基因(或DNA序列)擴增,使得樣本中原本數量極少的特定基因數量變得足夠龐大,從而能夠被光學法或其他體外診斷方法檢測出來。

PCR反應過程主要為三步:變性、退火和延伸。變性是通過加熱使DNA雙鏈打開形成單鏈。然后退火降溫,溫度降低后加入的引物會與DNA中互補區相結合。最后的延伸過程,在DNA聚合酶作用下,聚合酶催化引物延伸,合成出于DNA新鏈。以上的三個步驟為一個循環,通過不斷的循環半保留復制,一個DNA分子就會被復制成無數個同樣的DNA分子。

1 PCR反應過程

以上步驟完成了特定基因的擴增,后續就是對擴增基因的檢測。目前最為主流的檢測方法是熒光光學法,熒光PCR (qPCR)是第二代PCR技術,就是在PCR反應過程中加入熒光基團,通過直接測量激發后的熒光光信號強弱,從而實時、定量地檢測樣本中的特定基因。

熒光PCR因其簡便、安全、非接觸式的優點,得到了非常廣泛的應用。然而熒光PCR也有自己的缺陷,其依賴標準曲線和參考樣本、難以精確測定基因拷貝數、精確度也有不足的問題。這也是此次新冠疫情中,一些專家建議在核酸檢測的同時,參考胸片CT影像綜合診斷的原因。針對這些情況,能夠絕對定量的第三代PCR技術——微滴式數字PCR技術(Droplet Digital PCR, DDPCR)顯然具有更廣闊的應用前景。

2 qPCR典型原理圖

 

什么是微滴式數字PCR?

 

微滴式數字PCR是一種基于PCR反應的單分子絕對定量技術。原理是將含有核酸模板的標準PCR反應體系,平均分配為數以萬計的微液滴,盡可能使得每個反應中含有一個模板,然后進行單分子模板的PCR反應。這樣含有模板的液滴在擴增后就會具有較強的熒光,依次測量每一個微液滴讀取熒光信號,再針對熒光信號的有無計數就可以實現絕對定量。

3 微滴式數字PCR反應過程

dPCR通過對樣本的微滴化處理,大大提升了測量的靈敏度和準確性,只需要非常少的模板量就能夠進行檢測。此外,dPCR還彌補了qPCR系統需要嚴格依賴標準曲線的問題,測量絕對定量,對逐個微液滴的統計分析結果可靠。在實際應用中,dPCR還具備防污染和全集成的優點。PCR反應被嚴格局限于水相微液滴中,能夠有效避免接觸污染,也易于集成和自動化。

數字PCR的檢測靈敏度較熒光定量PCR1-2個數量級,更適合檢測微量痕量病毒,此次冠狀病毒感染也出現了早期癥狀不明顯、但核酸檢測呈陽性的的“潛在感染者”和“隱藏患者”。

借用一子,qPCR檢測突變像是在大海里撈一個會發光的針,周圍都是海水,很難看到針的光在哪,而dPCR就像把海水盛到好多個碗里面,瞧一眼很容易就知道哪個碗在發光了,而且,系統還會數出來到底有多少個碗里是發光的,多少個碗里是沒發光的,這樣一比,就很容易的知道有多少數量的突變,就能做到絕對定量了。

一句話概括:微滴式數字PCR:“(shǔ)(shù)

 

微滴式數字PCR的熒光檢測方法

 

dDPCR的熒光檢測主流方法主要有兩種,一種是以QuantStudio? 3D數字PCR系統為代表的微流控芯片加工法,另一種則是以Bio-rad QX200為代表的微滴法。這兩個產品也是目前國內三級醫院所使用的數字PCR主流產品。

QuantStudio? 3D數字PCR系統基于高密度的微流控芯片,將樣品均勻分布到多達20000個微孔中相互隔離。PCR反應后,通過高亮度LED光源激發熒光信號,使用冷CCD進行檢測,再讀取每個微孔的信號進行計數。

4 基于微流控芯片技術的數字PCR

Bio-rad QX200則是借助了微滴技術和微流體技術,借助微滴發生器生成20000個均一的微滴,經PCR反應后再將液滴吸入管路依次通過一個雙色光學檢測系統,再檢測陽性和陰性的微滴數量。

 

5 微滴式數字PCR典型檢測光路

5為一種典型的流式裝置光路布局:布置在側面的激發光源產生的激發光,經二色鏡反射并聚焦到微液滴流道上,微液滴在流道中依次排列一個個地通過聚焦位置,每個微液滴依次被照射產生激發熒光。熒光在被布置在下方的探測器收集,經過光電器件轉變為易于處理和分析的電信號。

QuantStudio? 3D之流的熒光成像法有幾個優點。

首先,可以高通量地檢測到帶有熒光信號的液滴,在一張圖像中可以同時檢測到數千個液滴。通過獨特的廣角鏡頭,甚至可以同時檢測到100萬個液滴。

其次,光學系統的設計相對簡單明了,甚至傳統的數碼單反相機都可以用來進行熒光成像。

第三,通過在多路檢測中添加多個熒光濾光片,可以方便地實現多色熒光成像。

然而,由于光源的穩定性變化和相鄰液滴間的熒光信號干擾,使得熒光成像的檢測靈敏度和動態范圍受到限制。

Bio-rad采用的激光誘導熒光(laser-induced fluorescence, LIF)細胞計數法,LIF中,液滴經過流式光路檢測,以每秒數百至數千液滴的速度檢測熒光信號。并且LIF檢測可以加上光學共焦檢測模塊,入射激光和發出的熒光信號分別通過針孔,通過抑制非焦平面的光學噪聲來提高信噪比。

LIF流式檢測可以獲得更高的靈敏度和動態范圍。然而,與熒光成像系統相比,LIF光學系統的設計相對復雜。不過對于臨床應用來說,高靈敏度的熒光檢測對于ddPCR獲得可靠、準確的患者標本診斷結果至關重要。

 

微滴式數字PCR的激發光源選型

實際應用中,因為微液滴尺寸非常小,單個微液滴的直徑僅約幾十微米,且在流道內高速流動,往往單個液滴接收到激發光照射的時間不到1微秒。這就要求激發光源發出的激發光必須在很短的時間內,使得聚焦位置達到足夠的光照強度,因此激發光必須同時具備光強度高、穩定性好的特點,因此最好采用高穩定激光器作為激發光光源。

此外,因為微液滴大小的限制,激光器本身的指向穩定性、功率穩定性和噪聲也有要求。

 

流式光路設計

來自英國的Qioptiq公司(EXCELITAS集團)是一家提供高端光子解決方案的供應商,有著齊全的光源、光學/電子學和探測器等產品線和很強的OEM能力,可以從零開始在短時間內設計和定制流式細胞儀等復雜光學儀器光路解決方案。對于PCR系統中流式光路部分,可以為定制者提供靈活可用的方案。這是一個省心并高效的選擇,在生命科學分析儀器中,可以兼顧廠商往往極為關心穩定性和實效性。

6  四通道流式原型機,從草圖到原型機僅用時8周。所有主要產品均來自EXCELITAS

組件:1、兩臺配有光纖Qioptiq iFLEX-iRIS?固態激光器;2、六個Excelitas LynX? SIPM探測模塊3、Qioptiq kineMATIX?光纖耦合器4、Qioptiq OPTEM顯微物鏡5、LINOS Microbench和軌道系統

采用的iFLEX系列激光是一系列低噪聲、高穩定的激光器,具備功率高度穩定、光束指向穩定性優異、超低噪聲,非常適合作為微滴式數字PCR系統的激發光源。直接搭配合束及整形輸出,可以將光路最簡化,以便盡量消除流式光路中各種潛在的光噪聲干擾。迷你的光纖激光模塊擁有即插即拔的KineFLEX專利技術,可以確保極端的穩定性。

7 定制的流式光路產品:雙波長激光光纖合束整形輸出所需光斑(約20*80μm)

 

“將高可靠性的激光源集成到OEM系統中,從而實現極致精度和照明性能?!?/span>

無限插拔的合束/分束/耦合光纖系統,可以讓光路更簡化、穩固、便捷設計。

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